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膜片钳

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  1. 技术简介

  膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是当前研究细胞膜电流及离子通道的最重要的技术。从技术层面来解释的话,膜片钳技术(patch clamp)是指利用钳制电压或者电流的方法(通常为钳制电压)来记录细胞膜离子通道电活动的微电极技术。“膜片”即一片细胞膜在早期的单通道记录中是指被玻璃微电极端口吸附、记录的一小片细胞膜,这一小片细胞膜可以含有一个或几个离子通道。后来,膜片钳技术发展出多中记录构型,“膜片”即可指各种单通道记录构型中的小膜片,也可指全细胞记录构型中被检测的整个细胞膜。“钳”,即人为控制之意,根据人为控制的电学参数不同,膜片钳技术可分为电压钳和电流钳两种工作模式。电压钳(voltage clamp,VC),即人为控制细胞膜两侧的电压差(即跨膜电位),在此条件下检测跨膜电流,具体的钳压要求视离子通道的特性而定。电流钳(current clamp,IC),则是人为控制施于细胞膜的电流,在此条件下观测跨膜电位。电压钳是膜片钳实验中常用的工作模式,它能较好的研究通道的电压依赖性,易于将其他刺激和膜电位改变引起的电学反应区分开来,在电压钳状态下记录的结果易于分析。

 

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图1 中科院水生所膜片钳系统

 

  2. 膜片钳技术的原理

  膜片钳技术的原理为:用一个尖端直径在1.5-3.0um的玻璃微电极接触细胞膜表面,通过负压吸引使尖端口与细胞膜形成千兆欧姆级的阻抗封接,尖端口内的细胞膜区域与周围其他区域形成了电学分隔,然后人工钳制此片区域细胞膜的电位,即可达到对膜片上离子通道电流的监测与记录。

  3. 膜片钳的工作流程

  (1)制备溶液-制备细胞用的电极内液和外液;调整溶液渗透压和pH值。

  (2)准备样本-准备培养细胞或脑片。

  (3)拉制玻璃微电极-准备记录电极。用电极拉制仪器拉制玻璃毛细管并抛光电极尖端。

  (4)设置灌流系统-确保系统处于屏蔽状态。

  (5)钳制细胞-使用三维操纵器控制电极接触细胞膜。确保细胞形成高阻封接。

  (6)信号采集和放大-放大信号。为了获取最佳实验结果,确保使用正确类型的放大器进行研究。

  (7)信号数模转化-对模拟信号进行数字化转化,以便对信号进行分析。

  (8)数据采集和分析-使用pCLAMP 11软件,根据实验目不同编程不同实验步骤,以实现更快的数据分析和精确测定。

 

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图2 膜片钳工作流程

 

  4. 膜片钳技术的基本记录模式

  膜片钳技术共有四种基本记录模式。

  (1)细胞贴附记录模式(cell-attached recording);

  当用微操纵器移动玻璃电极使其尖端轻压于细胞膜后,对电极施加一个负压力,可使细胞膜陷入玻璃电极端口,与电极内壁形成"Ω"形封接,电极内部和浴液之间的电阻可达1-100GΩ,此即为吉欧封接,使被吸附的膜片与浴液之间隔开。封接紧密,即使撤去电极内的负压力,封接仍能牢固维持,这就是细胞贴附记录模式。

  (2)内面向外记录模式(inside-out recording);

  先形成贴附式记录构型,在此基础上将电极提起,因高阻封接使电极尖端开口边缘与细胞膜的接触相当牢固,撕下一块膜片,在低钙溶液中,此膜片原来朝向细胞质的一侧朝向浴液,即可形成内面向外记录模式。

  (3)外面向外记录模式(outside-out recording);

  在形成全细胞记录构型基础上,将电极提起,玻璃电极尖端周围的膜片被扯断,附着于电极的细胞膜游离边缘相互融合,细胞膜原来的外侧仍朝向浴液,即外面向外记录模式。

  (4)全细胞记录模式(whole-cell recording)。

  在形成贴附式记录构型的基础上,进一步对玻璃电极内施加脉动式负压力,或(和)施加适当幅度、宽度的单脉冲点击,使玻璃电极尖端吸住的膜片破裂,电极内液和细胞内部连通,这就是全细胞记录模式。

 

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图3 膜片钳技术记录模式

 

  5. 膜片钳技术的应用

  Neher和Sakmann 在1976年发明了可用于检测细胞电生理特性的膜片钳技术。经过四十多年的发展,膜片钳技术在细胞电生理研究领域得到了广泛应用。

  (1)对细胞分泌的研究;

  (2)与药物作用有关的心肌离子通道研究;

  (3)对离子通道生理与病理作用机制的研究;

  (4)对单细胞形态与功能关系的研究;

  (5)对药物作用机制的研究;

  (6)在心血管药理方面的研究;

  (7)创新药物研究与高通量筛选的研究;

  (8)在神经科学领域中的研究。

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