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蛋白质定量分析服务

蛋白质定量分析服务

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  a.TMT™ 技术

  TMT™(Tandem Mass Tag™)技术是由美国Thermo Scientific公司研发的一种多肽体外标记技术,该试剂是专为通过串联质谱(MS)对不同样品中的蛋白质进行鉴定和定量而设计。本技术采用多种同位素的标签,标记多肽的氨基基团,经过LC-MS/MS分析,可同时比较2-16组不同样品中蛋白质的相对含量。

 

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图 TMT™技术示意图

 

  使用仪器:THERMO :Orbitrap Eclipse 、Orbitrap Exploris 480、QE plus 高分辨质谱。

 

  技术优势:可同时对2-16种不同条件样品进行蛋白质差异分析。适合广泛样品类型:胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等。与凝胶分离的蛋白质定量技术相比,TMT质谱定量技术可检测到更多类型的蛋白质分子,如低丰度蛋白质、强酸(碱)性蛋白质、<10KD或>100KD的蛋白质分子。

 

  应用领域:疾病标志物筛选、作用机制研究、植物抗逆研究、药物作用靶点研究、特殊功能蛋白质筛选。

 

  样品要求:

样品类型

样品要求(/组样品)

蛋白质提取物

浓度 >1μg/μl,蛋白质总量 >300μg

细胞样品

细胞量>107

组织样品

动物、微生物组织湿重>10mg;植物鲜嫩组织>100mg

体液样品

血液体积>500μl

 

  项目周期:

进展

时间周期

收样/质控

1-2个工作日

样品处理

5-6个工作日

质谱上机

3-4个工作日

数据分析

2-3个工作日

总计

不超过20个工作日

 

  备注:超过4个样本每增加1个增加5个工作日,如需加急请联系我方协商处理。

 

  b.Label-free

  蛋白质非标记定量技术(label-free)是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析,无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准,只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据,比较不同样品中相应肽段的信号强度,从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。

 

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图 Label-free定量蛋白组学服务流程

 

  使用仪器:THERMO :Orbitrap Eclipse 、Orbitrap Exploris 480、QE plus

 

  技术优势:蛋白质不需要进行标记,所需样品总量少,耗费低。

 

  应用领域:疾病标志物筛选、作用机制研究、植物抗逆研究、药物作用靶点研究、特殊功能蛋白质筛选。

 

  c.SWATH/DIA

  SWATH/DIA是一种全新的质谱全景式扫描模式,与传统的shot-gun技术相比,SWATH/DIA采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂,从而获得完整的肽段信息。应用 SWATH /DIA采集模式,一次实验即可获得完整的定量与定性结果,无需进行方法优化。它可以采集样品中所有化合物的信息,可以对所有化合物进行追溯、查询和分析。SWATH/DIA模式克服了shot-gun扫描随机性的问题,因而数据重复性更好。SWATH/DIA尤其适合富集纯化后的样品,比如IP后进行SWATH/DIA定量来检测与目标蛋白互作的蛋白。

 

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图 SWATH技术示意图

 

  使用仪器:AB SCIEX TripleTOF 5600 plus;

  THERMO :Orbitrap Eclipse 、Orbitrap Exploris 480、QE plus

 

  技术优势:

  ♦ 灵敏度高,它继承了MRM的数据采集模式,结合高分辨率的质谱系统,具有与MRM相当的灵敏度;

  ♦ 重复样品间的定量相关性可达到0.99以上;

  ♦ 定量准确度几乎与MRM技术相当;

  ♦ 定量范围可跨越4个数量级;

  ♦ 定量的效果非常好。

 

  应用领域:机理和调控机制研究、疾病标志物的筛选、用药及预后标志物筛选、疾病的分子分型。

 

  样品要求:

样品类型

样品要求(/组样品)

蛋白质提取物

浓度 >1μg/μl,蛋白质总量 >300μg

细胞样品

细胞量>107

组织样品

动物、微生物组织湿重>10mg;植物鲜嫩组织>100mg

体液样品

血液体积>500μl

 

  项目周期:

进展

时间周期

收样/质控

1-2个工作日

样品处理

5-6个工作日

质谱上机

3-4个工作日

数据分析

2-3个工作日

总计

不超过20个工作日

 

  备注:超过4个样本每增加1个增加5个工作日,如需加急请联系我方协商处理。

  案例一  沙门氏菌中PhoP依赖于酪氨酸磷酸化的降解机制

 

  项目简介

  研究材料用的是一种革兰氏阴性菌。细菌中有一类非常著名的感应外界信号并作出应答的系统,被称为二元调控系统。二元调控系统信号传导的基础是蛋白磷酸化。以其中最关键的PhoP/PhoQ系统为例,细胞膜上的感应蛋白PhoQ感受外界信号的刺激,发生自磷酸化,接着将磷酸根转移至调节蛋白PhoP上的特定天冬氨酸位点上,从而激活它。磷酸化的PhoP就可以调控下游一系列基因的表达,包括很多与细菌致病与毒力相关的基因。

 

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图 PhoP/PhoQ调节系统示意图

 

  项目流程

  a.磷酸化位点的鉴定

  为了鉴定PhoP蛋白上其他可能的磷酸化位点,首先IP纯化了过表达的PhoP,然后胶内酶解为肽段,通过质谱分析,发现PhoP上的一个酪氨酸磷酸化位点。这张二级质谱图包含丰富的碎片离子和酪氨酸磷酸化的特征亚胺离子(216.043),确定了该磷酸化位点。

 

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图 PhoP磷酸化位点的鉴定

 

  b.双甲基化定量分析

  利用基于双甲基化的定量蛋白质组学技术研究这个酪氨酸磷酸化对细菌的蛋白质组产生了哪些影响。典型的定量蛋白质组学的流程:培养野生型CmP菌株、模拟磷酸化的YD突变株、模拟非磷酸化的YF突变株,然后提取蛋白,酶解为肽段,双甲基化标记分别标记为轻中重,等比混合后,进行质谱检测和定量分析。

 

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图 双甲基化定量分析

 

  c.结果分析

  在两组生物学重复中,共同定量到了约1600个蛋白,其中上调的有200个,下调的有274个。相关性分析表明,两次之间的重复性很好。

 

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图 数据概述

 

  把文献中已报道的PhoP激活的蛋白的定量信息提取出来,做了这样一个热图(如下图),可以看出他们都在模拟磷酸化的菌株中显著下调了,而在模拟非磷酸化的YF菌株中基本没有变化。

 

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图 已知的PhoP激活的蛋白

 

  在检测PhoP和PhoQ蛋白水平和mRNA水平上的变化时,发现模拟磷酸化的Y到D突变后,PhoP在蛋白水平降低的程度远远大于PhoQ,而在mRNA水平上,两者的变化差别不大。

  通过体内蛋白的降解实验发现,PhoP在YD突变后,蛋白发生了降解。由下图可以看到,随着时间的变化,只有模拟磷酸化的YD突变发生了降解,而野生型PhoP、模拟非磷酸化的YF突变,以及同样会造成PhoP蛋白失活的D52A突变,都没有降解现象发生。

 

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图 体内蛋白的降解实验

 

  有功能的PhoP对细菌在抗病菌多肽环境中的生长和生存至关重要。从这个实验可以看出,模拟磷酸化的YD突变和PhoP失活的PhoP-菌株一样,对抗病菌肽的抵抗能力显著下降。

 

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图 抗病菌肽抵抗实验

 

  d.研究结论

  最后是一个简单的模式图,作为对以上这些发现的总结。当PhoP上已知的经典的D52被PhoQ磷酸化时,PhoP被激活而发挥重要的调控作用。而当这个Y位点被某个激酶磷酸化时,PhoP则会被降解掉,从而失去调控活性。

 

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图 PhoP降解模式图

持续更新中,敬请期待...

  1.蛋白质组学项目服务流程

 

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  2.蛋白质组学样品准备的一般原则

  a)确保样品状态良好,符合预期的表型或分子指标。

  b)带手套、口罩、头套进行操作,避免角蛋白污染。

  c)保证取材后的操作在冰上进行,并尽量操作迅速。

  d)依后续实验需求,做好分装,避免蛋白反复冻融。

  e)取材后,液氮速冻,- 80 ℃ 冰箱保存,干冰寄送。

 

  3.蛋白质组学服务项目对样品量的要求

样本类别

样本规格

银染或考染胶条

需条带肉眼清晰可见

细胞

蛋白质组学项目需1×106或体积>30 μL;磷酸化蛋白质组学项目需1×107

动物组织

蛋白质组学项目需鲜重100 mg;磷酸化蛋白质组学项目需500 mg

植物组织

蛋白质组学项目需鲜重200 mg;磷酸化蛋白质组学项目需1 g

 

备注:对于蛋白得率较低的样品,建议在条件允许的情况下,适当提高样品送样量;特殊样品,请联系公司技术人员协商送样量。

 

  4.蛋白质组学服务项目样本寄送指南

样本类型

样本寄送要求

胶条样品

将蛋白条带用干净的刀片切下,并切割为1 mm3的小块,装入进口EP管中及时送样,送样时需加冰袋维持低温。

细胞、细菌样品

需用预冷的PBS缓冲液清洗三次,以去除培养基的成分,清洗结束后,离心将上清弃去,液氮速冻后,干冰寄送。

动物组织样品

取材后冰上操作,迅速将组织剪成0.5 mm3的小块,用预冷的PBS清洗三遍,去除残余的血液,称重后,液氮速冻,干冰寄送。

植物组织样品

取材后,用预冷的PBS将材料表面的污物去除,沉重后,液氮速冻,干冰寄送。

蛋白溶液样品

最好测定蛋白浓度后,干冰寄送冻存的蛋白溶液(需指明缓冲液成分和浓度);或者将蛋白通过丙酮法沉淀下来,晾干后,干冰或冰袋寄送蛋白沉淀。

培养基上清

培养细胞至合适密度,用无血清培养基清洗三遍后,加入无血清培养基继续培养合适时间,收集培养上清,离心去除细胞后,使用0.22 μm的滤膜过滤,液氮速冻,干冰寄送。

血液样品

血液样品一定避免溶血,要求采集血液时同时制备为血清或者血浆样品,建议使用相应的采血管,之后通过离心的方式获得血清或血浆,按需求分装后,液氮速冻,-80℃冰箱保存,干冰寄送。

磷酸化样品

用于磷酸化分析的样品,处理样品过程中保持低温,裂解液中需添加蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂。

持续更新中,敬请期待...

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