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非靶向代谢组学

非靶向代谢组学

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  非靶向代谢组学(即发现代谢组学)是一种非假设方法,目的在于通过一次分析得到尽可能多的代谢物。主要是将对照组和实验组的代谢组(某一生物体的全部代谢物)进行比对,以找出其代谢物的差异,并探索差异代谢物之间的代谢通路。其分析一般包括:

  a.代谢谱分析(也称为差异表达分析):在一组实验和对照样品中,寻找丰度改变有统计学意义的感兴趣代谢物。

  b.鉴定:进行代谢谱分析后,测定这些代谢物的化学结构。

  c.解释:研究流程的最后一步,解释所发现的代谢物与生物过程或生物状态之间的关联。

 

  研究流程

  非靶向代谢组学研究流程主要可分为实验设计、样本收集及处理、代谢物提取及浓缩、样本检测、数据分析、代谢物鉴定,最终进行生物学解释等。由于代谢组的变化极快,且代谢物种类繁多、浓度差异大、化学性质各异、数据信息庞大等因素,导致每一个步骤都可能对结果产生较大影响,实现代谢组学标准化操作至关重要。

 

  技术平台

  非靶向代谢组学检测平台主要有核磁共振(NMR)、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS) 等分析平台,而每种平台都有一定的偏向性,研究者需要根据研究的目的、样本的类型等选择合适的分析平台,亦可以同时运用多种平台进行分析,达到更加完善、全面的研究目的。

 

表 非靶向代谢组学主要检测平台比较

主要检测平台

优点

缺点

NMR

1、高通量

2、普适性

3、良好的客观性和重现性

4、快速(2~3 min/样)

5、预处理简单,不需要衍生化和分离

6、无损伤性

7、能检测样品中大多数有机类化合物

8、仪器使用寿命长

1、检测动态范围窄

2、灵敏度和分辨率较MS低

3、样品用量相对大(0.1~0.5 mL)

4、仪器和维护成本昂贵

GC-MS

1、高通量

2、高精密度、灵敏度及重现性

3、具有可参考的标准谱图数据库,易于定性

4、样品用量适中(0.1~0.2 mL)

5、可检测样品中大多数有机和部分无机分子

1、需要衍生化

2、需要分离

3、分析速度较慢(20~40 min/样)

4、较难鉴定新化合物

5、不适用于难挥发性、热不稳定性物质的分析

LC-MS

1、高通量

2、高分别率、灵敏度

3、检测动态范围宽

4、样品处理简单,不需要衍生化

5、样品用量少(10~100 μL)

6、适用于热不稳定性、不易挥发、不易衍生化和分子量较大的物质

1、分析速度较慢(15~40 min/样)

2、缺少可以参考的标准谱图数据库

3、较难鉴定新化合物

4、成本较高

5、仪器寿命较短

 

  数据分析方法

  非靶向代谢组学得到的数据是复杂的、多维的,要深度挖掘其中的信息,需要充分应用化学计量学方法。得到数据后一般先对数据进行预处理,具体过程包括归一化、数据转化、中心化、标准化等步骤。只有经过预处理,实现对数据的简化和降维,建立可靠的数据模型,应用于代谢组学数据分析的模式识别方法主要包括非监督学习方法和有监督学习方法。

  非监督学习方法主要有:主成分分析法(PCA)、非线性映射、聚类分析等。有监督学习方法主要基于偏最小二乘法(PLS)、神经网络改进方法、最小二乘法-判别分析(PLS-DA)、正交最小二乘法(OPLS)等,其中PCA和PLS-DA是代谢组学常用的模式识别方法。

 

1

图 非靶向代谢组学数据处理过程

 

  样本类型

  血清 • 血浆 • 尿样 • 脑脊液 • 唾液 • 粪便 •微生物 • 细胞 • 植物 • 组织 • 其它

 

  服务周期

  武汉生物样本库公司提供的非靶向代谢组学服务和周期见下表:

平台

仪器型号

数据库

检测的化合物数目

检测周期

检测价格

GC-MS

Aglient 7890A/5975C

1、NIST
2、Fiehn RTX5
3、自建数据库

数十~上百种

约15个工作日

请询价

UPLC-TOF

SCIEX TripleTOF 5600 plus

1、自建数据库
2、METLIN
3、HMDB
4、KEGG

上千种

约20个工作日

请询价

  文献:Mathé EA, et al., Noninvasive urinary metabolomic profiling identifies diagnostic and prognostic markers in lungcancer. 2014, Cancer Research, 74(12):3259-70 (IF=9.32)

  实验材料:

  前期筛选样本(1005例):花费十年(1998~2007)收集样本:469例病人(治疗前尿液)+536例健康人

  后期验证样本(158例):近期(2008–2010)收集的样本:80例病人(治疗前尿液)+78例健康人

  组织样品:48例肿瘤组织及其周边非肿瘤组织

 

  研究流程:

  概述:前期非靶筛选+后期靶向MRM验证

 

  实验流程:

 

1

 

  研究结论:

  前期筛选:前期筛选样品的非靶向代谢组学分析,正离子模式下共检测到1807个信号,负离子检测到1359个。通过对吸烟相关代谢物(Cotinine、Nicotine-N’-oxide和Trans-3’-hydroxycotinine)的检测,发现可以很好的将吸烟人群与非吸烟人群区分开,验证了分析方法的可行性。

 

1

 

  数据分析:

  a.诊断与分型研究:应用统计学分析方法,排除人种和性别的干扰后,作者鉴定到了四个差异代谢物:NANA、Cortisol sulfate、Creatine riboside 和 561+(未鉴定物质)。ROC分析发现四个差异代谢物在所有人群中AUC值在0.63~0.76之间,在I-II期肺癌人群中在0.59~0.70之间。其中用Creatine riboside或者全部四种代谢物预测更加准确(P<0.00001)。

 

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  Overlap between signals that are predictive of lung cancer status in the training set based on the Random Forests classification.

 

1

  Receiver Operating Characteristic (ROC) analysis of individual metabolites and their combination

 

  b.预后研究:在综合考虑了性别、人种、疾病阶段、组织切片、吸烟史、放化疗、外科手术等多方面因素后作者发现高含量的NANA、Cortisol sulfate、Creatine riboside和561+带来不好的预后效果(存活率低),而且这四种代谢物与存活率的相关性是独立的但却有累加效应;在I-II期肺癌人群中,高含量的Creatine riboside和561+也会降低病人的存活率。

 

1

  Kaplan-Meier survival estimates in the training set are depicted for the top four predictive metabolites

  c.后期验证:同样使用非靶向代谢组学方法,发现在验证人群(80例病人+78例健康人)中Creatine riboside、NANA和561+在病人尿液中的含量都有显著升高。在排除年龄、性别与人种干扰后选择198例样品(92例病人+106例健康人)进行靶向代谢组学,验证了这四种代谢物与疾病的相关性。此外,为证明这四种代谢物的稳定性,作者样品保存两年后再次重复了实验,证明它们临床应用的价值。

 

1

  Abundance and validation of metabolites that were top contributors in the classification of patients as lung cancer or healthy controls.

  d.机理研究方面的延伸:作者最后在肿瘤组织中检测上述四种代谢物的含量,发现与邻近组织相比,肿瘤组织中Creatine riboside和NANA的含量明显升高,同时Creatine的含量也有增加。

 

1

  Linking urinary metabolites to lung cancer tissue metabolome.

  总结:

  本篇文章是非常经典的代谢组生物标志物研究范例,前期非靶向的筛选加上后期的靶向验证,非常值得借鉴学习。

  文章最后从体液类样品再次回归组织类样品,叩开了后期机理研究的大门,这种研究思路也非常值得临床研究借鉴。

持续更新中,敬请期待...

  (1)代谢组学送样量参考标准

检测策略/方法

血样

尿液

脑脊液

粪便 

微生物

细胞

组织

植物

非靶向代谢组

500ul

1ml

200ul

2g

250mg

107

250mg

250mg

靶向代谢组

500ul

1ml

200ul

2g

250mg

107

250mg

250mg

NMR代谢组

500ul

1ml

500ul

2g

500mg

107

500mg

500mg

 

  (2)代谢组学送样生物学重复性要求

  代谢组的差异变化是基因组变化放大效应的呈现,不同个体中代谢物的波动性也就较大。另一方面,代谢组学的差异分析一般是基于PCA和PLS-DA等多元统计分析方法进行的,只有较大的样本量抽提出的主成分才具有群体代表性。因此,相对于基因组学等技术方法,代谢组学要求样品的生物学重复要更多。

  a.临床标本大于30例;

  b.模式动物样品大于10例;

  c.植物微生物样品每组大于8例;

  d.细胞样品大于6例。

 

  (3)代谢组学送样品收集标准

样本类型

收集标准

血液

血清

静脉抽血3~4mL,置于采血管内(不放置任何抗凝剂及促凝剂);4℃静置30~60min(不超过2h),待血液凝固;3500rpm、4℃,离心10 分钟,待血细胞完全沉降后,吸取上层血清,保存于-80℃保存。

血浆

采集血液样本,置于含有适量抗凝剂(慎用Citrate 抗凝剂;NMR检测推荐用Heprin抗凝剂;质谱检测推荐用EDTA抗凝剂(K2、K3、Na、绝对不有Li)的采集管内;反复颠倒采血管,使抗凝剂与血液充分混匀;以2000-3000rpm离心10 min(血样采集后室温放置1h之内进行离心;血样采集后冰上放置可以在4 h内进行处理),上清液即为血浆;保存于-80℃冰箱。

尿液

 收集尿液(严禁加入叠氮钠等抑菌剂以免对质谱测试产生干扰)置离心管(推荐用PP材料)中,10000rpm、4℃,离心10 分钟,取上清液,置-80℃保存。建议在送样代谢组学 检测同时进行尿肌酐的检测。

其它体液样本

收集过程尽量不添加其它试剂,收集至离心管后液氮速冻,置-80℃保存。

细胞

贴壁细胞(每皿细胞量不少于1.0E7)

处理前将每皿细胞计数,弃去培养皿 中的培养液,每皿加入10ml 去离子水洗去培养基,震摇2s(不要过于激烈,防 止细胞破裂),加入15ml 的液氮淬灭(2mins),加入1.5ml,-80℃预冰的甲醇, 用刮刀刮。

不贴壁的细胞

将混悬液完整转移至1.5ml 的离心管中,4 °C,13000rpm 离心10min,取固定体积上清液(每皿取等量体积,尽量多取,比如0.8mL), 置1.5mL 离心管中,置-80℃保存。同时,将细胞碎片称重予以记录。

细胞培养液(2mL/例)

将每皿待测细胞培养液吸取固定体积,置2mL 离心管, 10000rpm、4℃,离心10 分钟,取上清液,-80℃保存。

粪便

 从粪便的不同部位挑取3个点,称重,置离心管中(严禁加入叠氮钠等抑菌剂以免对质谱测试产生干扰),-80℃保存。

组织

动物组织样本

全程冰上操作,尽量减少操作时间。去除血液(心、肝、肾、 肺可行心脏灌流,其他组织可用预冷PBS 淋洗数次)干扰,置液氮速冻,-80℃ 保存。

人组织样本及肿瘤样本

尽量减少操作时间。去除血液(预冷PBS 淋洗数次) 干扰,置液氮速冻,-80℃保存。

微生物及菌类样本

收集10^7 个/例细菌或500mg/例菌丝于离心管内,若菌丝无法判断具体量,可以黄豆粒大小为标准,迅速液氮速冻,-80℃保存。

植物样本

建议粉碎后称重,液氮速冻,-80℃保存。也可寄送未粉碎样品。

 

持续更新中,敬请期待...

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