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新鲜冰冻组织空间转录组测序

新鲜冰冻组织空间转录组测序

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Q&A

  技术原理

  当冰冻组织切片放置在带有spatial barcode的Visium 芯片的捕获区域内,进行HE染色和成像后,通过组织透化,细胞内的mRNA释放,被芯片上带有oligo-dT的探针捕获。被捕获的mRNA开始逆转录,得到的cDNA中包含spatial barcode序列,构建文库后通过测序,可以将mRNA转录的序列映射到组织中的原始位置,从而获得基因表达的位置信息。

 

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空间转录组技术原理

 

  Visim空间转录组的核心在于芯片部分:正式文库构建的芯片上有4个捕获区域,每个捕获区域约含有5,000个spot,每个spot能捕获1~10个细胞,spot与spot中心点之间的距离为100μm,每个spot 含有上百万个可以与mRNA结合的捕获探针,且每个探针上含有独一无二的条形码(spatial barcode)来标记空间位置信息。

 

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空间转录组基因表达芯片原理

 

  样本类型

  新鲜组织取样后立即进行OCT包埋处理后再冻存;如果无法立即进行包埋处理,则先将组织利用异戊烷速冻后再进行OCT包埋。

 

  实验流程

 

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空间转录组测序实验流程

 

  应用方向

  a.肿瘤异质性;

  b.组织形态学;

  c.组织发育机制;

  d.治疗干预反应;

  e.生物标志物发现;

  f.细胞图谱。

 

  产品优势

  a.全面了解疾病复杂性

  b.发现新的生物标志物,鉴定新的细胞类型和状态

  c.定位细胞图谱的空间结构

  d.识别时空基因表达模式

  案例一  人类背外侧前额叶皮层转录组规模空间基因表达

  研究人员使用10x Genomics Visium平台来定义六层人类背外侧前额叶皮层中基因表达的空间图谱,确定了广泛的层富集的表达特征和与以前的层状标记的精确关联。研究者将层表达特征覆盖在大规模单核RNA测序数据上,增强了表达驱动簇的空间注释。通过整合神经精神疾病基因集,展示了与精神分裂症和自闭症谱系障碍相关的基因的差异层富集表达,突出了空间定义表达的临床意义。其次,研究者开发了一个数据驱动的框架来定义空间转录组学数据中的非监视簇,该簇可以应用于形态学结构完好程度不如皮质层状组织的其他组织或脑区域。最后,他们为科学界创建了一个Web应用程序来探索这些原始数据和汇总数据,以助力正在进行的神经科学和空间转录组学研(http://research.libd.org/spatialLIBD)。

 

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Reference:Maynard K R , Collado-Torres L , Weber L M , et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex[J]. Nature Neuroscience, 2021:1-1.

 

  案例二  人鳞状细胞癌的组成和空间结构的多模态分析

  为了定义皮肤鳞状细胞癌(cSCC)的细胞组成和结构,研究人员选用一系列的人皮肤鳞状细胞癌和配对的正常皮肤样本,采用单细胞RNA测序与空间转录组学和多重离子束成像相结合的技术,整合高纬度多组学方法来描述人类皮肤鳞状细胞癌,确定肿瘤的异质性和空间定位。结果表明cSCC表现出四种肿瘤亚群,其中三种为正常表皮状态的类型,还有一种为癌症特有的肿瘤特异性角质形成细胞 (TSK)群体,它们定位于纤维血管生态位。整合单细胞和空间转录组数据将配体-受体网络映射到特定细胞类型,揭示出TSK细胞是细胞间通讯的枢纽。观察到潜在免疫抑制的多个特征,包括T调节细胞 (Treg)与CD8+T细胞在分隔的肿瘤基质中的共定位。最后,结合人类肿瘤异种移植物的单细胞表征和体内CRISPR筛选,确定了特定肿瘤亚群富集基因网络在肿瘤发生中的重要作用。这些数据定义了cSCC肿瘤和基质细胞亚群、它们相互作用的空间区位以及它们参与肿瘤细胞通讯的基因网络。

 

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Reference:Ji AL,Rubin AJ,Thrane K,et al.Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma[J].Cell,2020,2:497-514.e22.

 

  案例三  BayesSpace:实现更高分辨率的空间转录组分析

  空间转录组技术能够在保留空间背景的同时全面测量转录组谱。然而,现有的分析方法并没有解决技术分辨率有限或有效利用空间信息的问题。本文研究团队开发了BayesSpace,这是一种完全贝叶斯统计方法,它使用来自空间邻域的信息来增强空间转录组数据的分辨率并进行聚类分析。研究者针对当前的空间和非空间聚类方法对BayesSpace进行了基准测试,并表明它改进了对来自大脑、黑色素瘤、浸润性导管癌和卵巢腺癌样本的不同组织内转录谱的识别。通过使用免疫组化和从scRNA-seq数据构建的计算机数据集,结果表明BayesSpace解析了在原始分辨率下无法检测到的组织结构,并识别了组织学分析无法识别的转录异质性。其结果说明了BayesSpace在促进空间转录组数据集发现生物学新见解中具有重要意义。

 

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Reference:Zhao E , Stone M R , Ren X , et al. Spatial transcriptomics at subspot resolution with BayesSpace[J]. Nature Biotechnology, 2021:1-10.

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小鼠肾脏空间转录组的 mRNA 表达及聚类

 

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小鼠大脑空间分辨率的基因表达

 

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小鼠不同脏器的空间转录组图谱

  样本处理:新鲜组织取样后立即进行OCT包埋处理后再冻存;如果无法立即进行包埋处理,则先将组织利用异戊烷速冻后再进行OCT包埋。

  运输方式:干冰运输。

 

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人类不同脏器的空间录组图谱

 

  质控要求:组织切片提取RNA无降解,RIN值≥7;组织切片HE染色完整、无明显空隙。

  Q1:可以邮寄速冻组织吗?

  答: 不可以,建议新鲜样本使用OCT包埋好,进行邮寄;如有切片设备,可以切到目的区域后,再进行邮寄。

  Q2:样本制备的方法优先选择哪一种?

  答:样本制备选用新鲜的组织材料,“先冻存后包埋”、“先包埋后冻存”两种方法均可 。

  Q3:制备冷冻样本时为什么要加入异戊烷?

  答:液氮的沸点很低,组织直接放入液氮后会沸腾,容易改变组织内部形态甚至碎裂,破坏组织结构。异戊烷沸点没有那么低,预冷之后把组织放进去不会产生沸腾,这样组织形态不会改变。

  Q4:肿瘤异质性非常大,非常担心所选择区域不具有代表性,该怎么办?

  答:建议先用免疫组化/HE染色的方式,对感兴趣的组织区域进行筛选。

  Q5:信息分析可以关联高通量单细胞RNA-Seq测序吗?

  答:可以,通过两种组学各细胞基因表达量等相关数据,利用seruat软件进行关联分析,实现高通量单细胞数据补充注释空间转录组结果。

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